单细胞测序揭示出小鼠后肢发育过程中的细胞异质性和发育轨迹

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文章信息

本文预印于2019年6月的bioRxiv上，题目是：Single cell RNA-sequencing reveals cellular heterogeneity and trajectories of lineage specification during murine embryonic limb development.

  摘要  

小鼠后肢基因表达的协调和时间调控决定了间质祖细胞的特性及其形成的肌肉骨骼组织的多样性。为了鉴定肢体发育的细胞轨迹，我们使用单细胞mRNA测序（scRNA-seq）来分析E11.5-E18.5之间发育的小鼠后肢。使用RNA荧光原位杂交（FISH）来检查细胞类型和细胞轨迹的空间位置，以了解细胞成熟的祖先连续体。这些数据为后肢发育的转录程序提供了资源，支持肌肉骨骼发育的未来研究，和组织再生的假设。

 样品   

取材 E11.5、E13.5、E15.5、E18.5，后肢发育从起始到大致完成的4个阶段。

按照时间点取材，胶原酶消化成单细胞后，冻存1 x 10^6  cells per 500μl in freeze media (80%FBS, 10% DMEM, 10% DMSO), 做单细胞实验的时候再取出。

 测序   

• 使用10X Genomics，将四个时间点的样本分别和培养的人源293T细胞1:1混合, 检测单细胞的捕获率。

• 测序2500 cells/sample， 200K reads/cell，2700 genes/cell, 总计9466个细胞

• 数据 & 质控

  数据存放在https://github.com/satijalab/seurat

  过滤：200< 每个细胞表达的基因< 6000, 表达超过10%线粒体相关UMI的细胞被筛掉。同时也考虑了细胞周期情况。

 数据分析  

• 聚类：使用tSNE，分出 7 clusters，比较不同时期的后肢的细胞类型的不同，计算了不同cluster的比例。作者注意到，其中一个与有丝分裂关系较大的细胞群，在E11.5占比49%，到E18.5只占比8%。其中muscle相关细胞，在E11.5只有1%，到E18.5占比64%

• 细胞轨迹分析

  确定发育轨迹，使用p-Creode，https://github.com/KenLauLab/pCreode

 实验验证   

•  RNA FISH

  染了以下marker，cartilage (Col2a1), skin (Krt14), and muscle (Myog) tendon (Scx) andbone (Runx2) markers.

 总结   

作者工作量感觉不是很大，有一个单细胞测序和一个简单的RNA FISH。不知道现在只做一个单细胞测序能发到什么水平的文章。拭目以待。

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